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         SYBR Green I 染料是一種直接與雙鏈 DNA (dsDNA) 結(jié)合的熒光染料，是熒光定量PCR 最常用的DNA結(jié)合染料。在定量 PCR中，SYBR Green I可與雙鏈DNA（dsDNA）非特異性結(jié)合后發(fā)出熒光，則可以通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的SYBR Green I 熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測(cè)PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。游離狀態(tài)下，SYBR  Green I發(fā)出微弱的熒光，一旦與dsDNA結(jié)合，其熒光增加1000倍，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出現(xiàn)的dsDNA量成比例，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加；所以通過(guò)檢測(cè)PCR 反應(yīng)液中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，可以對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時(shí)還可以測(cè)定擴(kuò)增的目的DNA片段的熔解溫度。

使用說(shuō)明：

使用時(shí)，配置PCR反應(yīng)混合液，將10000×SYBR Green I濃縮液加入到PCR反應(yīng)體系，使終濃度為0.5× （0.2×到1×之間調(diào)整）。以上操作建議在冰上進(jìn)行。

注：①  反應(yīng)液配制方法和PCR 擴(kuò)增條件請(qǐng)參照DNA聚合酶使用說(shuō)明。

②  Realtime PCR 擴(kuò)增儀的使用方法，請(qǐng)參照各儀器說(shuō)明書(shū)。

注意事項(xiàng)：

使用濃度對(duì)熒光PCR結(jié)果的影響

SYBR Green I的使用濃度是保證熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)成功非常關(guān)鍵的因素。如果SYBR Green I的濃度過(guò)低會(huì)使熒光信號(hào)的變化降低，這就意味著低拷貝的樣品可能無(wú)法檢出；而在高濃度時(shí)，將會(huì)抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)效率。所以一般在使用SYBR Green I時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化使用濃度，反應(yīng)的終濃度為0.2×到1×之間。

鎂離子濃度的影響

提高鎂離子濃度可以降低SYBR Green I對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用。我們建議在用SYBR Green I進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)，鎂離子濃度比無(wú)SYBR Green I 的普通 PCR 反應(yīng)高出0.5～3mM。